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PCR的流程

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时间:2022-11-17????浏览: ??【 打印此页】??【 关闭


1、PCR的流程
1.1变性
       变性的目的是使模板DNA双链解旋成为单链以便与引物结合,通常加温至95℃(这是Taq酶进行30个左右循环而活力不致受到过多损失时能耐受的最高温度)。模板的完全变性对PCR成功与否至关重要,第一轮循环中变性时间往往为10min,然而根据经验,在其他各次的循环中一般95℃ 30s足以使各种模板完全变性。可能的情况下可缩短该步骤时间,因为变性时间过长会损害酶活性。当模板的G+C含量超过55%时,需要更高的变性温度,可选用来源于古细菌的DNA聚合酶,因为它比Taq酶更能耐受高温。
1.2退火(复性)
       模板变性成单链后,温度快速降至退火温度,引物与模板DNA单链的互补序列可发生结合。退火温度的选择至关重要,如果退火温度太高,引物不能与模板很好地结合,扩增效率将会非常低;如果退火温度太低,引物将产生非特异性结合,从而导致非特异性DNA片段的扩增。退火时间一般为30-60s,足以使引物与模板之间完全结合。
1.3延伸
       模板-引物结合物在Taq酶的作用下,沿着5’→3’的方向合成一条与模板DNA链互补的链。延伸时的温度常为72℃(Taq酶的最适温度为72℃-78℃)。在最适温度下,Taq酶的聚合速率约为2000bp/min。但作为一个由经验确定的规则是,靶基因的每1000bp的扩增产物的延伸时间被设计为1min。另外,延伸时间随扩增片段长短而定,甚至在所扩增目的基因的长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略。
 

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