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慢病毒转染实验技能

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时间:2023-01-12????浏览: ??【 打印此页】??【 关闭


一、实验材料及试剂
24孔板、CO2培养箱、酒精灯等;无血清培养基、MEM-α或DMEM、polybrene、慢病毒等。
 
二、实验内容
(1)、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时,将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。
2、第二天,用含有0.5ug/mL polybrene的2mL新鲜培养基替换原培养基,加入适量病毒悬液。37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤) 4小时后加入2mL新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时,用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白,一般转染48小时后可见明显荧光表达,72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率,可在转染后72-96小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选,可以在转染3-4天后开始加药。
(2)、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×105个/ml悬浮细胞中加入polybrene至0.5ug/mL和适量病毒,充分混匀。37℃孵育。或者150g室温离心4小时(选作,部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤) 4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。
 
三、注意事项
1、病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒,请不要打开排风扇。病毒操作时请穿实验服,带口罩和手套。
2、操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染,请马上用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头,离心管,培养板,培养液请于84消毒液或1%SDS 中浸泡过夜后弃。
3、用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤:拧紧培养瓶或盖紧培养板。用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前,用70%乙醇清理显微镜实验台。
4、如需要离心,应使用密封性好的离心管,或者用封口膜封口后离心,而且尽量使用组织培养室内的离心机。
5、脱掉手套后,用肥皂和水清洗双手。

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