PCR扩增过程的关键点

一、PCR扩增过程的关键点
1、PCR 扩增中随着拷贝数的增加经常会出现二聚体、非特异性条带（大小不对）的现象。
通过降低模板和引物浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量，提高退火温度，可以提高扩增特异性。此外引物设计的好坏是关键。除了按照常规引物设计规则外，构建载体时通常会在引物序列上添加酶切位点和保护碱基。

2、扩增的片段拖尾严重，产物在凝胶上出现弥散状态。
原因可能在于模板不纯、反应体系中各成分比例不合适、退火温度设置偏低、循环次数过多等。注意操作轻柔，PCR 扩增体系各组分严格参照说明书加入。

3、片段太长难扩增、发生错配概率大、测序出现点突变。
扩增中设置适宜的退火温度（60℃ 左右），循环次数（30 次左右）不要太多，酶量要适中。传统 Taq 酶便宜高效，但扩增长度有限，出错率高。针对少量模板、复杂模板、长片段、稳定性差模板、高 GC 含量模板的扩增，选取具有高扩增能力、高保真、可靠性强的聚合酶是解决问题的重要一环。