常规引物设计原则

一、常规引物设计原则
1、引物长度：18-30bp，常用 20-22bp 左右。
2、引物 Tm 值最好在 60℃ 左右，两条引物间 Tm 值要保持接近，最好不超过 5°C。
3、GC 含量 40%-60%，45-55% 为佳。
4、引物自身不应有连续 4 个及以上碱基的互补，避免形成发卡结构。
5、引物之间不应有连续 4 个及以上碱基的互补，避免形成引物二聚体。
6、3' 端避免连续碱基的重复，如 GGG 或 CCC 会导致错配的发生。
7、3' 端最后一个碱基最好是 G 或 C。
8、可使用 NCBI primer-blast 比对引物特异性。
一般在引物的 5′端添加酶切位点时（不影响扩增的特异性），根据酶切位点序列，需要添加不同种类和数量的保护碱基，多加 3 个碱基可以满足几乎所有限制性酶切要求，如常用 BamHI（CGCGGATCCGCG）,其保护碱基为蓝色部分。上下游引物最好加入不同的酶切位点，避免片段在连接过程中倒置，影响基因序列的正常表达。