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学术前沿
慢病毒包装实验有哪些步骤怎么判断滴度测定??
时间:2022-05-10    浏览:   【 打印此页】  【 关闭


  眼看着基因编辑越来越火,而慢病毒基因表达系统是目前广泛使用的基因编辑操作工具之一,因此慢病毒的包装也慢慢越来越火,成为目前各大实验室比较普遍的实验之一,然而,有不少科研小伙伴表示,慢病毒的包装实验步骤实在是太复杂啦,伤不起!
 
  下面博奥龙对的小编就为大家详细先容一下慢病毒包装实验的步骤以及滴度测定,供大家参考。
 
慢病毒滴度
 
  慢病毒包装实验的步骤及滴度测定
 
  慢病毒基因表达系统由用于表达特定基因的目的质粒及病毒gag/pol、Rev和VSVG等组分的包装质粒组成,其中包装质粒提供了病毒基因组m RNA包装成完整毒粒所必需的结构蛋白、聚合酶和包膜蛋白。
 
  HIV-1是慢病毒中最具特征性的病毒,第一个慢病毒载体系统即以其为基础构建的。慢病毒载体的构建原理就是将HIV-1基因组中的顺式作用元件和编码反式作用蛋白的序列进行分离。为了降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒的可能性,将包装成分的5’LTR换成巨细胞病毒(CMV)启动子,3’LTR换成SV40 polyA位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上,即一个表达gag和pol、另一个表达env。
 
  实验步骤
 
  一、前期准备:
 
  1)构建含有目的基因的病毒载体,抽提高浓度、高纯度的包装质粒和目的质粒;
 
  2)指数生长的293T细胞(培养条件:DMEM+10%FBS,37°,5%CO2)
 
  3)试剂:胎牛血清、DMEM、Opti-MEM、lipo2000
 
  4)仪器设备:荧光显微镜、、生物安全柜、超速离心机
 
  二、细胞分盘
 
  转染前一天,通过胰酶消化传代于10cm培养皿上,使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的80%以上)。将细胞置于含5%CO2的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。
 
  三、转染
 
  1)转染前1h换液(用10ml完全培养基置换旧的培养基)。
 
  2)制备包装质粒和目的质粒与转染试剂的混合物。
 
  a.取无菌5ml EP管,加入1ml无血清Opti-DMEM,加入8µg目的质粒和16µg病毒包装质粒(psPAX2:pMD2.G=1:1),充分混匀;
 
  b.取无菌1.5ml EP管,加入1ml无血清Opti-DMEM,将50µl转染试剂溶于Opti-DMEM中,充分混匀,静置5min;
 
  c.将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中,边滴加边轻轻混匀后在室温放置20分钟,使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合物。
 
  3)取出培养皿,将配置好的DNA-转染试剂混合物加入到培养皿中,轻轻混匀,做好标记,放回培养箱中。
 
  4)6~8h后吸去培养基,用4ml PBS清洗一次后,加入8ml新鲜完全培养基培养。
 
  四、收病毒
 
  转染后每隔24小时收集培养后的上清至50ml离心管,做好标记,并给细胞更换新鲜的完全培养基。最后一次收集病毒液后,将接触过病毒的枪头、离心管培养皿等物品用84消毒液浸泡后丢弃。
 
  五、纯化
 
  1)初纯化:将收集到的病毒上清液于3500rpm,离心10分钟,弃去沉淀,并用0.45μl滤膜对离心后的上清液进行过滤;
 
  2)将过滤好的病毒上清液分装到超速离心管中,两两对应配平衡(相差不能超过0.01g);
 
  3)30000rpm,4°离心2小时;
 
  4)离心结束后,可观察到离心管底一侧壁上有白色的病毒沉淀,可在外侧管壁上将白色沉淀用马克笔圈出,即做上标记。在生物安全柜中打开离心管,小心吸掉上清;
 
  5)每管加入40~100μl PBS,小心地将病毒沉淀吹散重悬;
 
  6)根据需要将病毒重悬液分装,于-80°冰箱中保存。
 
  六、慢病毒滴度的测定
 
  1)取4µl病毒样品,加到4µlDNase I酶反应体系中,将样品于37°水浴1h左右后94°灭活DNase I;
 
慢病毒滴度
 
  慢病毒滴度的测定
 
  3)稀释标准品质粒设置标准品的拷贝数梯度为105、106、107、108、109 2)加入2µl蛋白酶K于55°水浴1h后94°灭活蛋白酶K,消化病毒表面的外壳蛋白,暴露出病毒的基因组RNA,备用;
 
  拷贝数公式:拷贝数=摩尔数×6.02×1023=质量÷分子量×6.02×1023
 
  质粒分子量计算:此处可以用代码实现,大家可以自行找相关小工具,将质粒全部碱基输入,选择双链、环状,提交即可自动生成质粒的分子量,单位是“道尔顿Da”,即g/mol
 
  4)配置qPCR反应体系,每个样品和标准品设计3个复孔,qPCR反应体系如下:
 
慢病毒滴度
 
  慢病毒滴度的测定
 
  qPCR反应程序如下:
 
  慢病毒滴度
 
  6)计算待测样品的滴度:将待测样品的Ct均值带入标准曲线的函数公式,计算所加入的病毒样品模板拷贝数X,再换算成滴度。换算公式为:慢病毒滴度=10X×8(稀释倍数)/µl5)制作标准曲线:以每组标准品的Ct均值为纵坐标Y,其对应的拷贝数的对数为横坐标X,做标准曲线,得出标准曲线的函数公式及R平方值;
 
  对于不少科研人员来说,慢病毒包装实验步骤复杂且实验周期长,并且容易出各种问题,为了节省宝贵的时间建议大家选择慢病毒包装服务,博奥龙的慢病毒系统属于第三代慢病毒系统,生物安全性高,采用VSVG包膜,宿主范围广泛,慢病毒滴度高,其病毒滴度可以达到10^9TU/mL。
 
慢病毒滴度
 
  博奥龙的慢病毒载体有CMV、mCMV、CAG、PGK、UbC、EF1a、GFAP、NSE等多种启动子可供选择;而且还有EGFP、ZsGreen、tdTomato、mCherry、EYFP等多种荧光标记蛋白可供选择;抗生素筛选基因有Puromycin、Neomycin、Hygromycin等可供选择。
 
  您只需要提供相关基因信息(基因ID、名称、序列等),博奥龙将提供完整的实验流程报告、测序文件、实验图片、实验数据等,还可提供慢病毒感染各类细胞及动物的相关实验,为您提供全面的实验服务。
 
  博奥龙拥有专业的实验室及一流的实验设备,拥有近10年的科研技术服务经历,积累了多年的经验积累和技术保障,如果您有任何疑问,也欢迎您点击右边的在线咨询,专业的技术人员将随时为您解答。
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