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学术前沿
HRP标记抗体的方法和步骤是什么??
时间:2022-05-11    浏览:   【 打印此页】  【 关闭


  1.原理
 
  戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
 
  2.标记步骤
 
  (1)称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室温静置过夜。
 
  (2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟,收集棕色流出液。如体积大于5ml,则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中,缓慢搅拌。
 
  (3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。
 
  (4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml,继续搅拌3小时。
 
  (5)加0.2M赖氨酸0.25ml,混匀后,置室温2小时。
 
  (6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时。
 
  (7)3000rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
 
  (8)将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PBS缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。
 
  3.结果判定
 
  (1)定性及效价滴定:用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定(见本节(三)工作浓度的选择)。
 
  (2)定量和克分子比值测定:可用分光光度计测定(光程1cm)。
 
  酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4
 
  IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
 
  (3)本法标记步骤比较简单,重复性好。缺点是酶的利用率低,一般只有2-4%的酶与蛋白质结合。
 
  4.试剂及器材
 
  (1)0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS):取0.2M Na2HPO4 49ml,0.2M NaH2PO4 51ml,NaCl1.8克,加蒸馏水至200ml。
 
  (2)1.25%戊二醛液:取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS 1ml混合。
 
  (3)1M PH9.5碳酸盐缓冲液:取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
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