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学术前沿
多克隆抗体制备的流程步骤是什么??
时间:2022-05-13    浏览:   【 打印此页】  【 关闭


  抗血清,通常指人工被动免疫后所制成的多克隆抗体,它是免疫化学的主要内容。抗血清也成为免疫血清,主要有免疫原的制备、动物免疫、放血、抗血清的分离、抗血清的分析和鉴定。
 
  一、免疫原的制备
 
  免疫原,是人工将抗原制成能喇激机体引起体液或细胞免疫的反应物质。免疫原由质量好的抗原和佐剂制成。常用佐剂弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂。
 
  完全佐剂的具体制法:取羊毛脂:石蜡油1:3比例混合高压灭菌,每毫升加入1.5mg卡介苗制成,使用时同抗原1:1等体积混合,乳化为油包水状态。
 
  不完全佐剂为完全佐剂去除卡介苗制成。
 
  二、动物免疫
 
  常用于动物免疫的动物有家兔(新西兰大耳白、日本大耳白等)、羊(波尔山羊),豚鼠等,其中家兔对抗原的免疫反应性好、个体大小合适等优点使用最多,兔的GG不分亚类,实验中易于管理。用于免疫的动物要求适龄、健壮、无感染性疾病,雄性最好。
 
  免疫部位:多采用脚掌,腹股沟淋趋承、大腿肌肉,皮下等,采用多部位配合免疫效果好。
 
  免疫剂量根据免疫动物、抗原分子大小,免疫方案不同有较大的区别。根据抗原量不同,可分为微量,常量及大量免疫法。微量免疫抗原在微克级别;常量免疫抗原量在1-10mg左右:大量免疫抗原免疫剂量在50-100g:小鼠在微克级别,兔子在1毫克到几毫克间。
 
  三、微量采血、效价检测
 
  免疫动物最好先用5-10g的卡介苗刺激动物,激发免疫系统,通常称为基础免疫,7-10天可起到作用。接着注射第一针,产生初次抗体,IgM型抗体较多;24周注射第二针,免疫3-5次后微量采血检测效价,微量采血再免疫后7-10天采集。兔子采用耳缘静脉或动脉,羊可耳缘静脉也可颈静脉采血。
 
  免子采血:冬季血液流动缓慢,用双手揉槎免子耳朵,待耳中间动脉血管鼓起,用针头轻轻刺破动脉(注意,不要擦试酒精或其他液体),这时血液呈滴状流出,用EP管接住即可。夏季由于血液流动活跃,可采用静脉取血。
 
  羊:用剪刀或者电动推子将耳朵上的毛剃光,揉搓耳朵,待血管鼓起,用注射器抽取。
 
  检测效价的方法:简洁ELSA、免疫扩散、单向扩散。或者根据制备抗体的目的选择其他检测、分析方法。
 
  四、免疫血清的采集
 
  微里采血检测达到预期目的后,一次性放血处死。
 
  兔子、豚鼠采用心脏采血、羊采用静脉放血处死。
 
  豚鼠采血5-10ml',兔子100ml左右,羊,2500ml左右。小鼠用摘取眼球放血。血液,采血时注意无菌操作,采集后放入面积较大的无菌容器中,先室温凝固30,再放入37度温箱凝回,最后放入4度冰箱充分凝固。完全凝固后,采用3000-5000rpm离心20min得到透明血清。
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