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学术前沿
抗体的标记有哪些??
时间:2022-05-25    浏览:   【 打印此页】  【 关闭


  抗体可以通过不同的化学试剂交联到酶(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶),荧光染料(FITC、PE、APC等)、生物素(Biotin)、胶体金等。
 
  一、抗体/蛋白的辣根过氧化物酶(HRP)标记
 
  抗体标记HRP最为经典的方法为NaIO4氧化法,现将HRP糖基氧化成醛基,醛基与抗体的-NH2反应生成希夫氏碱,抗体分子与HRP分子形成稳定结构。标记的时候一般按照抗体分子与HRP分子摩尔比1:4的比例进行标记,此时,两者的质量约为1:1。
 
  SOP抗体/蛋白的HRP标记(NaIO4氧化法)
 
  标记以2mg抗体为例
 
  1.抗体/蛋白的处理
 
  1)待标记抗体/蛋白在50mM碳酸盐缓冲液(0.015M Na2CO3,0.035M NaHCO3,pH9.6)中透析,其间换液2次,抗体/蛋白浓度调整为2mg/ml;或者将高浓度的抗体用0.5M碳酸盐缓冲液(0.15M Na2CO3,0.35M NaHCO3,pH9.6)稀释到2mg/ml,如果原抗体/蛋白溶液中含有Tris、NH4+等游离氨基的试剂,必须透析除去。
 
  2.HRP酶的氧化
 
  1)称取2mg HRP干粉(Frdbio)溶于100μL ddH2O中。
 
  2)称取NaIO4 21mg,溶于1 mL的ddH2O中,汲取100μL NaIO4溶液与100μL的HRP溶液缓慢混合,4℃下静置30min,此时溶液为绿色。
 
  注意:此后的操作均在避光条件下进行。
 
  3)汲取2µL乙二醇缓慢加入氧化后的HRP溶液,室温避光静置30min,此时溶液为褐色。
 
  3.抗体的标记
 
  1)将氧化好的HRP溶液直接加入到已处理好的抗体/蛋白溶液中,室温反应2小时。
 
  2)称取0.4mg的NaBH4,溶解于20µL的ddH2O中,全部加入上步反应液中,4℃静置2hr(不能再透析),每30min摇动一次。
 
  3)PBS(pH7.2)透析过夜,标记液中加入体积比30%~50%的甘油,混匀后置于-20℃保存。
 
  抗体/蛋白的HRP标记(戊二醛法)
 
  参照多肽与载体偶联相关SOP Frdbio GA(Glutaraldehyde,戊二醛)介导多肽与载体偶联
 
  二、抗体/蛋白的FITC标记
 
  SOP FITC标记抗体/蛋白
 
  1)将待标记的抗体/蛋白(浓度≧1mg/ml)对标记反应液(90mM NaHCO3,10mM Na2CO3,126mMNaCl,pH9.0)透析三次(4℃)。
 
  2)将FITC(Frdbio)溶于DMSO中,浓度为20mg/ml。每次交联使用的FITC均应新鲜配制,避光。
 
  3)(抗体/蛋白质:FITC)=1mg:150μg的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中,边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀,避光4℃反应8hr。
 
  4)加入5M的NH4Cl至终浓度50mM,4℃终止反应2hr。
 
  5)将标记产物在PBS中透析四次以上,至透析液清亮。
 
  6)交联物的鉴定
 
  蛋白浓度(mg/ml)=[A280–0.31×A495]/1.4
 
  抗体/蛋白质:FITC比例=3.1×A495//【A280–0.31×A495]】,该值应介于2.5~6.5之间。
 
  7)FITC标记的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中,加入0.1%NaN3、1%BSA,30%甘油,短期保存于4℃避光,长期应该-20℃避光保存。
 
  三、抗体/蛋白的生物素(Biotin)标记
 
  一般每个抗体可以标记3-5个生物素,标记时,生物素与抗体的比率受抗体浓度影响,对于10 mg/ml的抗体溶液来说,生物素应超过蛋白12倍(摩尔数),对于2 mg/ml的抗体溶液应超过20倍,生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。
 
  蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。
 
  1、抗体/蛋白的前处理:
 
  1)选择适当截留的超滤柱中加入400μl标记反应溶液(0.1M PBS pH 7.2),加入1mg抗体,混匀。
 
  2)4℃,6,000rpm,离心2min,弃滤液;于超滤柱中再加入200μl标记反应溶液,混匀。4℃,6,000rpm,离心2min,
 
  3)重复步骤2 6到7次。
 
  4)混匀超滤柱中的残留的液体,室温静置1min;将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中,4℃,1000×g,2min,收集液体。
 
  5)取50μl PBS于超滤柱中混匀,静置1min。倒置超滤柱,4℃,6,000rpm,2min。收集液体。
 
  6)步骤4与步骤5的收集的滤液合并,用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml,4℃放置备用。
 
  2、生物素的标记:
 
  7)将生物素溶解在其合适的溶剂中(请参照所选生物素的说明书,不同的生物素其溶剂不同),浓度为20mg/ml,按照生物素与抗体分子摩尔比1:20的比例加入抗体溶液,室温反应1h。
 
  8)葡聚糖凝胶分离纯化/透析袋或者超滤管去除游离生物素及其他试剂。
 
  9)将抗体保存于合适的抗体保存液
 
  进行抗体标记的时候,需要对抗体性质、交联剂和标记物的性质非常了解,否则很难标记出高品质的抗体;标记量低,导致信号值低;标记量太高,不但容易造成背景,并且还容易由于标记物的聚集造成信号拮抗,反而降低或者淬灭信号值。标记物的种类繁多,不同类型的标记物其性质完全不一样,光是标记物都很难选择和把握,建议初学者使用专业化的试剂盒进行标记,或者直接委托专业化企业标记。福因德生物提供以下抗体标记相关产品,同时可以提供抗体/蛋白标记服务。
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