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学术前沿

多种常见的抗体标记方法解析??

时间:2022-05-25    浏览:   【 打印此页】  【 关闭


  抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等,还有一些其他的标记方法例如金标记,本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
 
  一、酶标记
 
  1、辣根过氧化物酶(HRP)标记
 
  辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基,加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合,形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合,在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了,用试剂稳定Schiff氏碱。这里先容两种程序。
 
  程序一:
 
  (1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液,混匀,盖紧瓶塞,室温避光作用2小时。
 
  (2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
 
  (3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水,或纯化单抗等(15mg/ml),混匀。
 
  (4)称取Sephadex G25干粉0.3g,加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧,室温作用(避光)3小时或4℃过夜。
 
  (5)用少许PBS将交联物全部洗出,收集洗出液,加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液,混匀,室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液,混匀,室温作用1小时(或4℃过夜)。
 
  (6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化。
 
  (7)酶结合物质量鉴定:
 
  克分子比值测定
 
  酶量(mg/ml)=OD403×0.4
 
  IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62
 
  克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量,一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体,标记率一般为0.3-0.6,即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上,标记率可大于0.6,0.8,0.9;OD403/OD280等于0.4时,E/P约为1。
 
  标记率=OD403/OD280
 
  酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性,抗体活性及效价、特异性。
 
  (8)HRP抗体结合物的保存:加入等量甘油后,小量分装-20℃存放,防止反复冻融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚防腐,否则会影响酶活性。必要时冻干保存,以BSA或脱脂牛奶作保护剂。
 
  程序二:
 
  (1)将5mg HRP溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中,加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml,室温搅拌作用1小时,以封闭HRP分子上的α和ε氨基。
 
  (2)再加1ml 0.06mol/L过碘酸钠溶液,在室温中避光轻搅30分钟,溶液呈黄绿色;随后加1ml 0.06mol/L乙二醇,轻搅1小时,中止氧化反应。
 
  (3)移入透析袋中,在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液中,4℃透析过夜,更换三次缓冲液,注意避光。
 
  (4)汲取上述醛化好的HRP溶液3ml,加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml,室温轻搅2-3小时,避光;加入5mg NaBH4,4℃放置3小时或过夜,或换用乙醇胺(2mol/L PH9.5)0.2ml,作用7小时。
 
  (5)再移入透析袋中,在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小时,更换三次缓冲液。
 
  (6)用3000r/min离心30分钟,除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次,沉淀用少许PBS溶解,透析或层析除盐,必要时进一步层析纯化。
 
  (7)、(8)步骤同程序一。
 
  2、碱性磷酸酶(AP)标记
 
  碱性磷酸酶(AP)用于标记抗体,常用戊二醛一步法,将酶和单抗混合,再加入适量戊二醛,使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合,制备成结合物。该法简便,但所得产物不均一,抗体活性损失大,酶标记率低。其程序如下:
 
  (1)将5mg AP加入1ml抗体溶液(2mg/ml)中溶解,装入透析袋,于4℃对0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小时,换液三次。
 
  (2)加入2.5%戊二醛20ul,室温作用1-2小时,4℃对PBS透析过夜,其间换液三次。
 
  (3)换用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液透析,4℃过夜,换液三次。
 
  (4)取出标记抗体,用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml,即为AP标记物原液。
 
  (5)每毫升中加入0.4ml甘油,小量分装,保存备用。
 
  3、PAP、APAAP的制备
 
  PAP(过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术)、APAAP(碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术)的制备对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔PAP、APAAP试剂供应,只要配以相应的桥抗体,即可非常便利地应用单抗。因为PAP法和APAAP法不用任何化学交联剂处理酶和抗体,它们的活性均不受化学因素的影响,提高了敏感性和特异性。PAP和APAAP试剂的制备方法常采用先将HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物,再加入酶盐水,过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应,调PH至2.3,随后马上中和,除去不溶解的沉淀物后,加入半饱和硫酸铵,纯化PAP或APAAP。
 
  根据需要还可将PAP和APAAP试剂先与相应桥抗体结合后,再与特定单抗组成完整的诊断试剂,这样,单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
 
  二、荧光素标记
 
  1、异硫氰酸荧光素(FITC)标记
 
  FITC标记抗体的原理是在碱性条件下,FITC的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合,形成IgG与荧光素的结合
 
  物。FITC是常用的荧光素,其次选用TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明)。FITC和TRITC是常用的双标记组合。其标记步骤如下:
 
  (1)以碳酸盐缓冲液(PH9.3,Na2CO3 8.6g,NaHCO3 17.3g,蒸馏水1000ml)调整抗体浓度至10mg/ml。
 
  (2)取5ml抗体溶液置于10ml小烧杯中。
 
  (3)称取1mg FITC溶于0.2ml DMSO中,待溶解后马上缓慢滴加于抗体液内,边加边轻搅;其后室温避光作用2小时。
 
  (4)将交联物经Sephadex G25或G50柱层析除去游离的荧光素。
 
  (5)FITC的结合物质量鉴定
 
  IgG量(mg/ml)=(OD280-OD495×0.35)/1.4
 
  F/P=2.87×OD495/(OD280-OD495×0.35),一般说,FITC对抗体的摩尔比为3:1时适合于组织切片染色,为5-6:1时适合于细胞悬液染色。以标记抗体染色各种抗原,测定其特异性染色滴度和非特异染色的程度。
 
  (6)标记抗体的保存:宜保存于4℃,加NaN3防腐。
 
  2、异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记:基本与FITC标记相同。
 
  三、同位素标记
 
  必须强调的是在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前,应掌握同位素操作和防护常识。正常情况下应包括避免物理的接触和对γ-射线照射的有效保护,操作和使用同位素标记抗体时,应利用防护装置,并合理处置含放射性的废料。
 
  1、碘标记
 
  用碘标记抗体是一种有效的标记方法。125I衰变产生低能的γ和χ射线,很容易被检测出来,而其60天的半衰期保证足够的有效使用期,且能很方便地处理放射废料。常用的碘标记方法是氯胺T法,即将氧化剂氯胺T加入到抗体和碘化物的溶液中,Na125I在氯胺T作用下I转化成I2,游离I2可与抗体分子中酪氨酸和一些组氨酸发生卤化反应,用还原剂和游离酪氨酸终止反应,经凝胶过滤将标记的抗体与碘化酪氨酸及还原剂分离开。其主要操作步骤如下:
 
  (1)在进行标记之前,先选用截流分子量为20000-50000的凝胶,制备1ml凝胶柱,然后分别用10倍体积的1%BSA/PBS/0.02%叠氮钠和PBS洗涤柱体,封住柱下口,备用。
 
  (2)加入10ug纯化单抗至含有25ul 2.5mol/L磷酸钠(PH7.5)的1.5ml指形管内。随后,加入500uCi Na125I混匀。
 
  (3)加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。室温放置60秒。再加入50ul氯胺T终止液(含2.4mg/ml偏重亚硫酸钠,10mg/ml酪氨酸,10%甘油和0.1%环乙烷酰二甲苯的PBS)。
 
  (4)将上述碘标记物上样在凝胶柱表面,小心放开柱体下口,用1.5ml指形管收集。当碘标记物全部进入柱体,加入0.3ml含0.03%叠氮钠的PBS,用另一指形管收集0.3ml,然后再加0.3ml 0.03%NaN3 PBS,下口收集0.3ml,重复进行,同时用同位素检测仪测定标记与未标记的单抗。标记抗体大约在第二至第四管出现。无害化处理柱子和非单抗标记部分。
 
  (5)将标记单抗保存于4℃可使用6周时间。
 
  2、生物合成法标记
 
  将杂交瘤细胞培养在含有放射性前体的培养基中,随着抗体分子的合成、组装,同位素会标记在抗体分子的初级氨基酸链上,本方法不会导致抗体活性的丧失。其主要步骤是:
 
  (1)离心收集处于对数生长期的杂交瘤细胞,约需2×106个细胞。以预热37℃不含甲硫氨酸的培养基洗涤上述细胞。
 
  (2)用含2%PBS不含甲硫氨酸的培养基悬浮杂交瘤细胞至106个/ml,加入35S甲硫氨酸(每次加入100uCi可产生105-106cpm的抗体)。
 
  (3)经C02培养箱中培养过夜,离心后,吸出培养上清,分别加入1/20体积的1mol/L Tris(PH8.0)及叠氮钠至浓度0.02%。该标记抗体可按纯化单抗方法进行。
 
  四、生物素标记
 
  生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。其主要步骤是:
 
  1、用二甲基亚砜配制10mg/ml的N-羟琥珀酰亚胺生物素(应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯)。
 
  2、用硼酸钠缓冲液(0.1mol/L,PH8.0)稀释单抗溶液至1-3mg/ml。
 
  3、每毫克抗体加入25-250ug的生物素酯,混匀后,室温作用4小时。
 
  4、按每250ug生物素酯加入20ul 1mol/L NH4Cl终止反应,室温放置10分钟。
 
  5、以PBS充分透析除去游离生物素,标记抗体冻存。
 
  五、其他标记技术
 
  适用于蛋白质的其他标记方法也可用于单抗,如金标记、化学发光标记、SPA标记、铁蛋白标记等。
 
  免疫标记是一种操作简单、灵敏度高的技术,主要原理是级联方法效应。单抗已经广泛用于疾病诊断等,主要是利用单抗标记的诊断试剂盒进行的。
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